今天给大家分享一篇发表在Angewandte Chemie International Edition（IF=16.6）上的题为“Profiling the Heme-Binding Proteomes of Bacteria Using Chemical Proteomics”的研究论文。文章通过化学蛋白质组学技术全面分析细菌中的血红素结合蛋白。该方法可以应用于不同细胞类型和系统,并为未来的血红素生物学研究提供支持。

研究背景：

血红素（Heme）是一种多功能的辅助因子，对于大多数生物体都是必不可少的。病原体的生长和宿主定植所需的铁元素，是人体免疫应答中的一个关键组成部分。然而，由于细胞外游离铁元素有限，病原体进化出了从宿主中获取铁的能力。其中，血红素和血红蛋白这些血红素结合蛋白（HBPs）成为它们获取铁的重要来源。因此，血红素获取和代谢途径可作为原生动物寄生虫、结核分枝杆菌和革兰氏阴性菌的潜在治疗靶点。

然而，除了在少数模式生物中进行的研究外，我们对于血红素获取、生物合成和调节的了解甚少。目前对于血红素结合蛋白的研究仅限于可溶性溶解物或提取物,通常是采用亲和色谱法，然后利用SDS-PAGE或LC-MS来鉴定纯化后的蛋白，而在活细胞中明确发现血红素结合蛋白的方法尚未被报道。本文采用的化学蛋白质组学方法将有助于我们更全面地理解血红素的重要性，并为开发针对血红素作用的新型治疗策略提供更可靠的基础。

研究结论：

探针设计

研究人员首先基于血红素的结构设计并合成了血红素探针，这些探针会以代谢的方式整合到活菌当中。这些探针包含了Click反应基团，以便后续鉴定时将探针-HBP复合物富集出来。由于血红素通常至少有一个丙酸侧链暴露用于结合靶点分子，因此研究人员选择了两个丙酸基团作为功能化位点，用于探针的合成。

由于大多数血红素结合蛋白以非共价方式与血红素结合，于是研究人员在探针中引入了光亲和标签（双吖丙啶），能够通过紫外线交联连接靶标，从而大大增加了鉴定的蛋白数量。为了进一步研究光亲和标签的位置对探针活性的影响，研究人员合成了具有线性、分支或末端双吖丙啶标记的光亲和血红素探针（探针4、5、6），并通过体外测定了这些分子探针的活性。

血红素探针的验证

革兰氏阳性菌-粪肠球菌V583无法自主合成血红素，但在外源性血红素存在时会改变血红素结合蛋白的表达。文章首先在V583中进行了初步实验，使用探针、血红素以及DMSO分别处理V583，通过质谱评估不同处理对血红素结合蛋白的影响。与对照DMSO相比，血红素或探针1处理对血红素结合蛋白的表达影响相似(图2a)，证明探针1在活菌中被结合的方式与血红素相似。进一步使用探针2、3和4验证，发现它们的作用与探针1类似。

随后，研究团队又评估了探针在革兰阴性细菌-铜绿假单胞菌PAO1中的活性。PAO1在缺铁和缺血红素的培养基中生长到指数期后，分别使用探针4、血红素处理。质谱结果显示，两种处理对蛋白表达的影响没有差异，表明血红素探针在革兰阳性和阴性菌中均具有替代血红素的能力。

不同菌的血红素结合蛋白分析

研究人员通过定量质谱技术，在革兰氏阳性菌粪肠球菌V583中检测到五种血红素结合蛋白(图a)。随后又在革兰阳性模式菌种枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中进行验证，该菌能够利用外源性血红素合成细胞色素C，并可弥补HemA突变体中血红素生物合成的损失。作者首先进行了探针竞争性依赖标记实验(图b)，然后通过对六种血红素探针进行分析，鉴定出二十种血红素结合蛋白(图d)，其中血红素单加氧酶HmoA和HmoB最多(图c)。

革兰氏阳性菌血红素结合蛋白分析

接下来，研究者继续对革兰阴性菌株铜绿假单胞菌PAO1进行分析，竞争性实验表明存在血红素特异性结合(图a、b、f)。GO分析发现，特异性结合的蛋白质与血红素相关功能有关，如细胞色素C过氧化物酶和氧化酶活性、血红素结合蛋白、氧化还原酶活性。研究人员还在致病性大肠杆菌CFT073中进行了血红素蛋白组分析，发现了15种血红素结合蛋白，包括血红素酶、转运蛋白和伴侣蛋白。

考虑到生长阶段和营养条件可能会影响蛋白质的表达，研究人员在6种探针和7种不同标记条件下，共发现了57种不同的PAO1血红素结合蛋白。此外，还在裂解液中进行了血红素蛋白组分析，与活菌分析相比，血红素结合蛋白的富集显著减少。

革兰氏阴性菌血红素结合蛋白分析

化学蛋白质组学揭示潜在的血红素相互作用

近期有研究预测了铜绿假单胞菌PAS1结构域（含有还原反应传感器激酶MxtR），可以通过序列匹配结合血红素。研究人员通过光亲和探针6证实该结构域可以被富集（图a）。研究人员还对先前未加注释的血红素结合蛋白进行了筛选，得到了每种物种潜在的血红素相互作用蛋白列表（图b），然后运用机器学习的方法预测了单个基序的血红素结合亲和力，并列出了具有潜在亲和力的位点。

文章总结

该研究利用化学蛋白质组学技术，合成了六种血红素探针，其中包括三种光亲和探针。研究结果显示，在革兰氏阳性和阴性的活菌中，血红素探针的吸收和结合方式与未修饰的血红素类似，在血红素营养缺陷型和非营养缺陷型细菌中也是如此。这些探针随后被用于富集和鉴定来自4种主要致病性的革兰氏阳性和阴性细菌中的血红素结合蛋白。

为增加富集的血红素结合蛋白的覆盖面，研究人员结合了多种探针和各种生长条件，在4种不同的细菌中富集到了总血红素结合蛋白组中32-54%的蛋白。而在未通过该策略富集的已知血红素结合蛋白中，质谱法未检测到显著比例的血红素结合蛋白。

本文这种对活菌中血红素结合蛋白质组进行全面表征的方法是一种先进的技术，可以很容易适用于获取血红素的其他靶细胞类型。对血红素结合蛋白进行分析可以鉴定新的抗生素靶点,并为血红素调节和生物学提供有价值的见解。